Pregabalin không phải là chất chủ vận thụ thể GABAA hoặc GABAB.
Pregabalin là một gabapentinoid và hoạt động bằng cách ức chế một số kênh canxi.Cụ thể, nó là phối tử của vị trí phụ của tiểu đơn vị α2δ của một số kênh canxi phụ thuộc vào điện thế (VDCC), và do đó hoạt động như một chất ức chế các VDCC chứa tiểu đơn vị α2δ.Có hai tiểu đơn vị α2δ liên kết với thuốc, α2δ-1 và α2δ-2, và pregabalin cho thấy ái lực tương tự đối với (và do đó thiếu tính chọn lọc giữa) hai vị trí này.Pregabalin liên kết chọn lọc với tiểu đơn vị α2δ VDCC.Mặc dù thực tế là pregabalin là một chất tương tự GABA, nó không liên kết với các thụ thể GABA, không chuyển đổi thành GABA hoặc một chất chủ vận thụ thể GABA khác in vivo, và không trực tiếp điều chỉnh vận chuyển hoặc chuyển hóa GABA.Tuy nhiên, pregabalin đã được phát hiện là làm tăng biểu hiện não của L-glutamic acid decarboxylase (GAD) phụ thuộc vào liều lượng, loại enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp GABA, và do đó có thể có một số tác dụng GABAergic gián tiếp bằng cách tăng mức GABA trong não.Hiện tại không có bằng chứng cho thấy tác dụng của pregabalin là do cơ chế nào khác ngoài việc ức chế các VDCC chứa α2δ.Theo đó, việc ức chế các VDCC chứa α2δ-1 bởi pregabalin dường như chịu trách nhiệm về tác dụng chống co giật, giảm đau và giải lo âu của nó.
Các α-amino axit nội sinh L-leucine và L-isoleucine, gần giống với pregabalin và các gabapentinoids khác về cấu trúc hóa học, là các phối tử rõ ràng của tiểu đơn vị α2δ VDCC có ái lực tương tự như gabapentinoids (ví dụ: IC50 = 71 nM đối với L- isoleucine), và có trong dịch não tủy của người ở nồng độ vi cực (ví dụ: 12,9 μM đối với L-leucine, 4,8 μM đối với L-isoleucine).Người ta đã giả thuyết rằng chúng có thể là phối tử nội sinh của tiểu đơn vị và chúng có thể cạnh tranh đối kháng với tác dụng của gabapentinoids.Theo đó, mặc dù các gabapentinoids như pregabalin và gabapentin có ái lực nano đối với tiểu đơn vị α2δ, nhưng hiệu lực của chúng in vivo lại nằm trong khoảng micromolar thấp và sự cạnh tranh để gắn kết bởi các axit amin L nội sinh được cho là nguyên nhân gây ra sự khác biệt này.

Pregabalin được phát hiện có ái lực cao hơn 6 lần so với gabapentin đối với các VDCC chứa tiểu đơn vị α2δ trong một nghiên cứu.Tuy nhiên, một nghiên cứu khác cho thấy Pregabalin và gabapentin có ái tính tương tự đối với tiểu đơn vị α2δ-1 tái tổ hợp ở người (Ki = 32 nM và 40 nM, tương ứng).Trong mọi trường hợp, pregabalin có tác dụng giảm đau gấp 2 đến 4 lần so với gabapentin và ở động vật, có vẻ mạnh hơn gabapentin từ 3 đến 10 lần so với thuốc chống co giật.