Pregabalin không phải là chất chủ vận thụ thể GABAA hoặc GABAB.
Pregabalin là một gabapentinoid và hoạt động bằng cách ức chế một số kênh canxi. Cụ thể, nó là phối tử của vị trí tiểu đơn vị α2δ phụ trợ của một số kênh canxi phụ thuộc vào điện áp (VDCC), và do đó hoạt động như một chất ức chế các VDCC chứa tiểu đơn vị α2δ. Có hai tiểu đơn vị α2δ liên kết với thuốc là α2δ-1 và α2δ-2, và pregabalin cho thấy ái lực tương tự đối với (và do đó thiếu tính chọn lọc giữa) hai vị trí này. Pregabalin có tính liên kết chọn lọc với tiểu đơn vị α2δ VDCC. Mặc dù thực tế rằng pregabalin là một chất tương tự GABA, nhưng nó không liên kết với các thụ thể GABA, không chuyển đổi thành GABA hoặc một chất chủ vận thụ thể GABA khác trong cơ thể và không điều chỉnh trực tiếp sự vận chuyển hoặc chuyển hóa GABA. Tuy nhiên, pregabalin đã được phát hiện là tạo ra sự gia tăng biểu hiện trong não của L-glutamic acid decarboxylase (GAD), enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp GABA, và do đó có thể có một số tác dụng GABAergic gián tiếp bằng cách tăng nồng độ GABA trong não. Hiện tại không có bằng chứng nào cho thấy tác dụng của pregabalin được điều hòa bởi bất kỳ cơ chế nào khác ngoài việc ức chế VDCC chứa α2δ. Theo đó, sự ức chế VDCC chứa α2δ-1 của pregabalin dường như là nguyên nhân gây ra tác dụng chống co giật, giảm đau và giải lo âu của nó.
Các axit α-amino nội sinh L-leucine và L-isoleucine, gần giống với pregabalin và các gabapentinoid khác về cấu trúc hóa học, là các phối tử rõ ràng của tiểu đơn vị α2δ VDCC có ái lực tương tự như gabapentinoids (ví dụ: IC50 = 71 nM đối với L- isoleucine), và hiện diện trong dịch não tủy của con người ở nồng độ micromol (ví dụ, 12,9 μM đối với L-leucine, 4,8 μM đối với L-isoleucine). Người ta đưa ra giả thuyết rằng chúng có thể là phối tử nội sinh của tiểu đơn vị và chúng có thể đối kháng cạnh tranh với tác dụng của gabapentinoid. Theo đó, trong khi các gabapentinoid như pregabalin và gabapentin có ái lực ở cấp độ nano với tiểu đơn vị α2δ, thì hiệu lực in vivo của chúng nằm trong phạm vi micromol thấp và sự cạnh tranh để liên kết bởi các axit L-amino nội sinh được cho là có thể là nguyên nhân gây ra sự khác biệt này.

Pregabalin được phát hiện có ái lực cao gấp 6 lần so với gabapentin đối với VDCC chứa tiểu đơn vị α2δ trong một nghiên cứu. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác cho thấy pregabalin và gabapentin có ái lực tương tự với tiểu đơn vị α2δ-1 tái tổ hợp ở người (Ki = 32 nM và 40 nM, tương ứng). Trong mọi trường hợp, pregabalin có tác dụng giảm đau mạnh hơn gabapentin từ 2 đến 4 lần và ở động vật, nó dường như mạnh hơn gabapentin từ 3 đến 10 lần trong vai trò thuốc chống co giật.